細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿

細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿（如瓊脂平板培養(yǎng)皿）是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的工具，用于細(xì)菌的分離、純化、計(jì)數(shù)及藥敏試驗(yàn)等。以下是其使用過程的詳細(xì)步驟及注意事項(xiàng)：  

一、使用前準(zhǔn)備  

培養(yǎng)皿選擇  

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適材質(zhì)（如玻璃或一次性塑料）和尺寸（如90mm、60mm）的培養(yǎng)皿。  

檢查培養(yǎng)皿是否完好無損，避免使用有裂紋或污染的培養(yǎng)皿。  

培養(yǎng)基準(zhǔn)備  

瓊脂平板：將滅菌后的瓊脂培養(yǎng)基（如LB瓊脂、血瓊脂）冷卻至50-60℃，倒入無菌培養(yǎng)皿中，厚度約3-4mm。  

凝固：水平放置培養(yǎng)皿，待瓊脂凝固（約30分鐘），避免晃動產(chǎn)生氣泡。  

標(biāo)記：在培養(yǎng)皿底部用記號筆標(biāo)注實(shí)驗(yàn)信息（如細(xì)菌名稱、日期、操作者等），避免在蓋子上書寫以防混淆。  

無菌環(huán)境準(zhǔn)備  

在超凈工作臺或生物安全柜中操作，提前開啟紫外燈照射30分鐘滅菌，操作前用75%乙醇擦拭臺面。  

穿戴無菌手套、口罩和實(shí)驗(yàn)服，避免皮膚或衣物接觸培養(yǎng)皿內(nèi)部。  

二、接種操作  

接種工具準(zhǔn)備  

根據(jù)接種方法選擇工具：  

涂布法：無菌涂布棒（L形玻璃棒）。  

劃線法：無菌接種環(huán)（鎳鉻合金或一次性塑料環(huán)）。  

打孔法：無菌打孔器（用于藥敏試驗(yàn)）。  

接種環(huán)/棒需在酒精燈火焰上灼燒至紅熱，待冷卻后使用（避免高溫殺死細(xì)菌）。  

接種方法  

涂布法（適用于定量分析）：  

用移液器吸取100μL菌液，均勻滴加在瓊脂表面。  

將無菌涂布棒平放在培養(yǎng)皿蓋上，蘸取少量乙醇后點(diǎn)燃滅菌，冷卻后輕壓菌液并旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使菌液均勻涂布。  

劃線法（適用于分離單菌落）：  

用接種環(huán)蘸取少量菌液，在瓊脂表面劃“Z”形或“S”形線條，每次劃線后灼燒接種環(huán)并冷卻，重復(fù)操作直至覆蓋整個平板。  

打孔法（藥敏試驗(yàn)）：  

在瓊脂表面均勻接種細(xì)菌后，用打孔器在平板上打孔（直徑約6mm）。  

向孔中加入不同濃度的抗生素溶液，培養(yǎng)后觀察抑菌圈大小。  

封口與培養(yǎng)  

用無菌膜或培養(yǎng)皿蓋密封，避免雜菌污染。  

根據(jù)細(xì)菌生長需求調(diào)整培養(yǎng)條件（如溫度37℃、CO?濃度5%、培養(yǎng)時間18-24小時）。  

需氧菌倒置培養(yǎng)（防止冷凝水滴落污染菌落），厭氧菌使用厭氧袋或罐培養(yǎng)。  

三、觀察與記錄  

菌落觀察  

培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)（大小、顏色、形狀、邊緣、透明度等），初步鑒定細(xì)菌種類。  

記錄菌落數(shù)量（用于計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)）或抑菌圈直徑（藥敏試驗(yàn)）。  

污染檢查  

若培養(yǎng)皿中出現(xiàn)非目標(biāo)菌落（如霉菌、酵母菌），可能為污染，需重新實(shí)驗(yàn)。  

四、使用后處理  

滅菌處理  

未使用的培養(yǎng)皿：若已開封但未接種，需重新高壓蒸汽滅菌（121℃,15分鐘）后丟棄。  

已接種的培養(yǎng)皿：  

含普通細(xì)菌：121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘。  

含致病菌或高風(fēng)險微生物：按生物安全要求進(jìn)行化學(xué)消毒（如含氯消毒劑浸泡）或焚燒處理。  

廢棄物分類  

將滅菌后的培養(yǎng)皿放入醫(yī)療廢棄物專用袋，標(biāo)注“感染性廢棄物”后統(tǒng)一處理。  

五、注意事項(xiàng)  

無菌操作  

整個過程需嚴(yán)格無菌，避免說話、咳嗽或快速移動導(dǎo)致空氣流動污染。  

接種環(huán)/棒冷卻后接觸菌液，防止高溫殺死細(xì)菌。  

培養(yǎng)條件控制  

不同細(xì)菌需特定培養(yǎng)條件（如溫度、氣體環(huán)境），需提前查閱文獻(xiàn)或標(biāo)準(zhǔn)方法。  

避免頻繁開蓋觀察，防止雜菌污染。  

安全防護(hù)  

處理致病菌時需在生物安全二級實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）操作，佩戴護(hù)目鏡和防護(hù)服。  

實(shí)驗(yàn)后用肥皂洗手，避免交叉污染。