酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁比較厚，不容易破壁，不如大腸桿菌的質(zhì)粒容易提取，較近做了些釀酒酵母的實(shí)驗(yàn)，從釀酒酵母中提取質(zhì)粒，現(xiàn)在就總結(jié)下實(shí)驗(yàn)的方法和步驟。
一、酵母細(xì)胞質(zhì)粒提取步驟
接種單菌落(待檢測(cè)酵母細(xì)胞)于25mLYNB(補(bǔ)加氨基酸 營(yíng)養(yǎng)物)培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
第二天取一滴菌液于進(jìn)行顯微鏡下觀察,目鏡用16,物鏡用40倍觀察細(xì)胞壁破碎前的狀態(tài),其成桿狀,流動(dòng)性比較下。
取10ml的培養(yǎng)酵母菌液,5000g離心3min,棄上清液.加入5ml的1倍TE懸浮。
將懸浮液倒入高壓破壁儀的樣品管中,利用高壓破碎機(jī)進(jìn)行破碎細(xì)胞壁,壓力加到20Mpa,停留15s,降壓,反復(fù)來(lái)回壓3次.取出細(xì)胞液,取一滴于顯微鏡下觀察,如果細(xì)胞呈不規(guī)則的球狀時(shí),而且其流動(dòng)性 比較大,說(shuō)明其細(xì)胞壁已經(jīng)破碎成為原生質(zhì)體。
取2個(gè)EP管,每管加入1.5ml上述的細(xì)胞液,12000g離心5min,收集原生質(zhì)體.棄取上清液,每管加入300ul10%的SDS溶液,混勻冰浴5min,進(jìn)行破原生質(zhì)體。
然后加入150ul的tris飽和酚,和150ul的鹵仿異戊醇混合液(鹵仿:異戊醇=24:1),混勻,12000g,離心10min。
將水相移到另一EP管中,加入等體積的鹵仿異戊醇混合液(鹵仿:異戊醇=24:1), 混勻,12000g,離心10min。
將水相移到另一EP管中,加入1/10體積的3M KAC溶液和2倍體積的無(wú)水乙醇,放入-20℃冰箱中。
1h,12000g離心10min,倒出乙醇,等干燥后加入1ml的70%的無(wú)水乙醇,混勻,12000g,離心10min。
棄去乙醇,等室溫干燥后,每管加入20ul的TE溶液(如要去處RNA酶,加入1ul的100mg/ml濃度的RNA酶),放入-20℃冰箱即可。
跑電泳進(jìn)行檢測(cè)是否從酵母菌中提出質(zhì)粒了。
酵母破壁方法
我給你介紹兩個(gè)必叫簡(jiǎn)單點(diǎn)的酵母破壁方法，非常實(shí)用，我作過(guò)很多實(shí)驗(yàn)，這兩個(gè)方法是我自己總結(jié)出來(lái)的，希望對(duì)你有用。
酵母的細(xì)胞壁比較厚,不易破，而且細(xì)胞壁中含有的一些成分容易影響以后的實(shí)驗(yàn)，所以破壁的步驟非常關(guān)鍵!其他步驟只要你按照說(shuō)明就可以了。
酚氯仿劇烈振蕩方法破壁：培養(yǎng)好的1ml酵母細(xì)胞在STE溶液中洗滌兩次后，用70ulTE緩沖液重旋!加入50ul玻璃珠(sigma公司)，加入80-100ul酚氯仿，劇烈振蕩5-10分種后，使用氯仿抽取去除酚和蛋白，然后按照其他步驟沉淀就可以得到你的質(zhì)粒，DNA的提取也可以使用這種方法。
反復(fù)凍融破壁：培養(yǎng)好的1ml酵母細(xì)胞在STE溶液中洗滌兩次后，加入200ul緩沖液[2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0)]，使用液氮和96-98度沸水反復(fù)凍融3-5次，然后使用酚氯仿抽提蛋白!其余步驟參考其他文獻(xiàn)。
酵母質(zhì)粒提取可以用試劑盒提取，也可以直接用裂壁酶處理后采用堿裂解法提取質(zhì)粒，缺點(diǎn)就是提取的量很少，還會(huì)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象，明明有卻條帶，檢測(cè)卻不正確。
